## 培养条件

气相组成：95%空气 + 5%二氧化碳；温度设置为37℃。培养基中添加10% FBS及1% P/S。该细胞系由尊龙凯时的DJGriad实验室通过肺癌组织移植建立，患者为一名58岁白人男性。

A549细胞可以通过胞苷二磷酸胆碱的途径合成富含不饱和脂肪酸的卵磷脂。传代时，首次建议采用1:2的比例。关于传代情况，建议每两天更换培养液。为了确保细胞健康，建议同时购买多管细胞，尊龙凯时提供极具吸引力的价格优惠。收到细胞后，处理至良好状态，灌满完全培养液并封好瓶口，是运输细胞的最佳做法。

在处理细胞之前，使用75%酒精对细胞瓶进行全面消毒，然后在超净工作台内进行严格的无菌操作。接着，将细胞瓶放入37℃、5% CO2的培养箱中静置3-4小时，以稳定细胞状态，再进行后续处理。同时，在显微镜下观察细胞的生长情况，并拍摄不同倍数的照片保存（推荐各拍摄40x、100x、200x的图片）。前三天的照片是重要的售后依据，未提供照片则默认细胞状态良好。

## 细胞培养步骤

当细胞的汇合度未超过80%时，请将瓶内的完全培养液收集至离心管，保留5ml完全培养基，并放入37℃、5% CO2孵箱培养。若细胞密度超过80%，则可进行传代。贴壁细胞的传代步骤如下：

1. 弃去培养上清液，使用无钙、镁PBS清洗细胞1-2次。
2. 向培养瓶中添加0.25%胰蛋白酶消化液约1-2ml，置于37℃培养箱中消化1-2分钟后观察细胞状态，若细胞大部分变圆并开始脱落，则迅速取回操作台，轻轻敲打培养瓶后加入超过5ml的完全培养基终止消化。
3. 轻轻吹打细胞使其完全脱落后吸出，转移悬液至15ml离心管中，并在1000RPM条件下离心5分钟，弃去上清液后补加1-2ml完全培养基重悬。
4. 按1:2的比例将细胞悬液分瓶传代至两个T25瓶，补充新的完全培养基至每瓶5-8ml，最后将其放入37℃、5% CO2的细胞培养箱中继续培养。

1. 采用半换液法处理：在培养箱中静置培养瓶约1小时，轻轻吸掉约3ml培养基后，补充3ml完全培养基。如果培养基变色较慢，可以直接添加约500ul的FBS。传代时，可以直接添入5ml的培养基，分为两个培养瓶进行，每三次传代后可进行一次离心传代以去除死细胞。

2. 采用离心换液法：如果需要分瓶，可以将细胞悬液收集至离心管，1000RPM离心5分钟，弃去上清液后补加1-2ml培养液进行重悬，再将细胞悬液按1:2的比例分至新的T25瓶中，添加6-8ml按照说明书配置的新完全培养基以保证细胞的生长活力，后续传代根据实际细胞情况按1:2至1:5的比例进行。

1. 当细胞生长至覆盖T25培养瓶80%面积时，弃去培养液，用PBS清洗细胞一次。

2. 添加0.25%胰蛋白酶消化液约1ml至培养瓶中，观察直到细胞回缩变圆后加入5ml完全培养基终止消化，轻轻吹打使细胞脱落，然后将悬液转移至15ml离心管中，1000RPM离心5分钟。

3. 弃去上清液，沉淀细胞后加入1ml的无血清冻存液（货号：C7001），充分混匀后转移至冻存管中。

4. 将冻存细胞直接存放于-80℃冰箱中，如后期需转入液氮罐，需在-80℃冰箱中至少存放24小时后再转入液氮罐。

1. 从液氮中取出细胞冻存管（需佩戴防护具），迅速放入37℃水浴中解冻至冻存管中无结晶，然后用75%酒精清洁冻存管外壁。

2. 将冻存管中的细胞转移至含5ml完全培养基的15ml离心管中，1000RPM离心5分钟。

3. 弃去上清液，沉淀后用5ml完全培养基重悬，并接种至T25培养瓶中，放入37℃、5% CO2的培养箱中培养。

4. 第二天，更换为新鲜的完全培养基继续培养。

## 注意事项

某些细胞可能在运输过程中因为贴壁不牢而脱落，这是正常现象。如果细胞脱离严重，可以将培养瓶内所有培养液收集至离心管，1000RPM离心5分钟，收集上清液作过渡培养（可供后期对比），沉淀加入1-2ml胰酶，轻轻吹打后重悬，消化1-2分钟后添加5ml完全培养基终止反应。再进行离心，弃去上清液，加入1-2ml完全培养基重悬。随后，按1:2比例进行分瓶传代至两个T25培养瓶，补充新的完全培养基至5-8ml/瓶，最后放入37℃、5% CO2的细胞培养箱中继续培养。