尊龙凯时细胞培养指导

**一、培养条件**

气相成分：95%空气 + 5%二氧化碳；培养温度：37℃。

**二、传代方法**

初次建议传代比例为1:2。每2天更换培养液，以保持细胞生长的良好状态。建议同时购买尊龙凯时的其他培养产品，以享受优惠。

收到细胞后，请进行适当处理，确保培养至最佳状态。之后，将培养瓶填满完全培养液并封口，以确保运输安全。

在处理细胞之前，请用75%酒精对整个细胞瓶进行消毒，然后在超净台内进行无菌操作。将细胞瓶放置于37℃、5%CO2的培养箱中静置3-4小时，以帮助细胞稳定后再进行后续处理。

在进行显微镜观察时，请记录细胞的生长情况，并拍摄不同倍数的照片（推荐40x, 100x, 200x各一张）。前三天的照片将作为重要的售后依据，如未提供照片则默认收到的状态良好。

**三、细胞培养步骤**

1. 细胞传代：

当细胞汇合度未超过80%时，将瓶中的完全培养液收集至离心管中，保留5ml完全培养基放入37℃、5%CO2孵箱中；如果细胞密度超过80%，则可进行传代。贴壁细胞的传代步骤如下：

（1）弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS洗涤细胞1-2次。

（2）添加0.25%胰蛋白酶消化液（约1-2ml），在37℃培养箱中消化1-2分钟，实时观察细胞消化情况，若大部分细胞呈圆形并脱落，快速轻敲培养瓶后，加5ml以上的完全培养基终止消化。

（3）轻轻吹打细胞使其完全脱落后，吸出悬液，转移至15ml离心管中，1000RPM离心5分钟，弃去上清液并补加1-2ml完全培养基重悬。

（4）将细胞悬液按1:2的比例分瓶传代（两个T25瓶），并补充新的完全培养基至5-8ml/瓶，最后放入37℃、5%CO2的培养箱中培养。

2. 悬浮细胞传代：

（1）半换液法：将培养瓶竖直放置在培养箱中静置约1小时，轻轻吸掉约3ml的培养基，然后补充3ml的完全培养基。如培养基颜色变化缓慢，可直接加入500μl左右的FBS。传代时直接补给5ml培养基于两个培养瓶，一般此方式传代3次后可离心传代一次，去除死细胞。

（2）离心换液法：如需分瓶，将细胞悬液收集至离心管中，1000RPM离心5分钟，弃去上清，加入1-2ml培养液重悬混匀后，按1:2分至新T25瓶中，添加6-8ml新配置的完全培养基确保细胞的生长活力，后续可根据需要以1:2~1:5的比例继续传代。

**四、细胞冻存**

1. 当细胞覆盖培养瓶的80%时，弃去培养液，用PBS洗涤细胞一次。

2. 添加0.25%胰蛋白酶消化液（约1ml），显微镜下观察，待细胞回缩变圆后加入5ml完全培养液终止消化。轻轻吹打细胞使其脱落，转移至15ml离心管中，1000RPM离心5分钟。

3. 弃上清，沉淀的细胞加入1ml尊龙凯时无血清冻存液（货号：C7001），混匀后转入冻存管。

4. 将冻存细胞直接放入-80℃冰箱，如需转入液氮罐，请在-80℃冰箱中存放24小时后再进行转移。

**五、细胞复苏**

1. 从液氮中取出细胞冻存管（注意佩戴防护装备），迅速置入37℃水浴中解冻，直至无结晶后用75%酒精擦拭冻存管外壁。

2. 将冻存管中的细胞转移至含5ml完全培养基的15ml离心管中，1000RPM离心5分钟。

3. 弃上清，沉淀用5ml完全培养基重悬，接种至T25培养瓶，放于37℃、5%CO2的培养箱中培养。

4. 次日更换新鲜培养基继续培养。

**注意事项**

运输过程中部分细胞可能会发生脱落，这是正常现象。如脱落较多，请将培养瓶中的培养液收集至离心管，1000RPM离心5分钟，收集上清作过渡培养；沉淀后加入1-2ml胰酶，轻轻吹打，再次消化1-2分钟后加5ml完全培养基终止反应。最后再离心，弃去上清，加入1-2ml完全培养基重悬，按照1:2比率进行分瓶传代（两个T25），并补充新的完全培养基至5-8ml/瓶，最后放入37℃、5%CO2的细胞培养箱中培养。