### 培养条件

培养气相条件为95%空气和5%二氧化碳，温度控制在37℃。培养基使用DMEM，添加10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素（P/S）。所用的A-673细胞系来源于一位15岁女性的横纹肌肉瘤，能够在软琼脂中形成克隆，并可以在接受免疫抑制血清处理的小鼠中形成肿瘤。

此细胞系具有四个以上的标志染色体、一个额外的F染色体以及两个异常的B染色体。传代时建议以1:2的比例进行，通常每两天更换培养液。

尊龙凯时建议同时购买完整的培养基，确保细胞运输和培养的最佳效果。收到细胞后，应及时处理并培养至良好状态，完全填满培养瓶并封好瓶口以便于运输。

收到细胞后，应使用75%酒精喷洒整个细胞瓶进行消毒，然后在超净台内按照严格的无菌操作进行培养。将细胞瓶放入37℃、5%CO2的培养箱静置3-4小时，以便细胞稳定后进行后续操作。观察细胞的生长情况，并用不同倍率的显微镜拍照（最佳比例为40x、100x、200x各一张），前三天的照片是重要的售后依据，如果没有提供照片则默认细胞状态良好。

### 细胞培养步骤

**A. 细胞传代：** 如果细胞未超过80%的汇合度，将培养瓶中的完全培养液收集到离心管中，留取5ml培养基并放回37℃、5%CO2孵箱继续培养。如果细胞密度超过80%，则可进行传代。贴壁细胞的传代步骤如下：

1. 弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。
2. 添加0.25%胰蛋白酶消化液约1-2ml至培养瓶中，放入37℃培养箱消化1-2分钟，并在显微镜下观察细胞的消化状态。快速轻敲培养瓶，然后加入5ml以上的完全培养基以终止消化。
3. 轻轻吹打细胞使其完全脱落后吸出，然后将悬液转移至15ml离心管中，在1000RPM下离心5分钟，弃去上清液，补加1-2ml完全培养基重悬。
4. 将细胞悬液按照1:2的比例分瓶传代（两个T25瓶），并补充新鲜的完全培养基至5-8ml每瓶，最后放入37℃、5%CO2的细胞培养箱中继续培养。

**B. 悬浮细胞传代：**

1. 采用半换液法，竖着放置培养瓶在培养箱静置约1小时，轻轻吸掉约3ml培养基，再补充3ml的完全培养基。如果培养基颜色变化缓慢，可以直接加入约500ul的FBS进行调整。在传代时，可以直接补给5ml培养基并分到两个培养瓶中。一般情况下，经过3次此法传代后可考虑离心传代以去除死亡细胞。
2. 离心换液法：如需分瓶，可将细胞悬液收集到离心管中，在1000RPM离心5分钟，废弃上清后补加1-2ml培养液重悬，并按1:2的比例将细胞分至新T25瓶中，添加6-8ml配置好的新完全培养基以保持细胞的生长活力。后续的传代应根据实际情况按1:2至1:5的比例进行。

**C. 细胞冻存：**

1. 当细胞生长覆盖培养瓶面积达到80%时，弃去T25培养瓶内的培养液，用PBS洗涤细胞一次。
2. 添加0.25%胰蛋白酶消化液约1ml至培养瓶中，在显微镜下观察细胞的状态，待细胞呈现回缩状态后加入5ml完全培养液以终止消化，轻轻吹打使细胞脱落，然后将悬液转移至15ml离心管中，进行1000RPM离心5分钟。
3. 弃去上清，沉淀细胞后加入1ml的无血清冻存液（产品编号：C7001），混匀后转移至冻存管中。
4. 将冻存细胞直接放入-80℃冰箱保存。如果需要将细胞转入液氮罐，则需在-80℃冰箱中存放24小时以上后再转移。

**D. 细胞复苏：**

1. 从液氮中取出冻存管（注意佩戴防护面具），快速放入37℃水浴中解冻，直至冻存管中无明显结晶，然后用75%酒精擦拭冻存管外壁。
2. 将冻存管中的细胞移至含5ml完全培养基的15ml离心管中，在1000RPM下离心5分钟。
3. 弃去上清，重悬细胞于5ml完全培养基中，接种至T25培养瓶，并放置于37℃、5%CO2的细胞培养箱中继续培养。
4. 次日更换为新鲜完全培养基继续培养。

### 注意事项

某些细胞可能在运输过程中容易脱落，这是正常现象。若细胞脱落较多，可将培养瓶内的培养液收集至离心管中，1000RPM离心5分钟，收集上清用于后续对照培养。沉淀后加入1-2ml胰蛋白酶，轻轻吹打后重悬，消化约1-2分钟后加入5ml完全培养基终止消化，再离心、弃上清并重悬于1-2ml完全培养基中。之后按1:2的比例进行分瓶传代（两个T25瓶），补充新鲜培养基至5-8ml/瓶，最后放入37℃、5%CO2细胞培养箱中培养。

借助尊龙凯时的相关产品和技术，您将能够更有效地进行细胞培养及操作，确保细胞实验的成功与稳定。