在生物医学领域，甘油菌种的复苏与保存是确保微生物研究和应用成功的关键环节。此过程中涉及多个重要步骤，包括菌种的保存、复苏及再次保存。以下将详细介绍相关步骤及注意事项。

菌种保存

首先，将菌种接种于LB液体培养基，并在对数生长期内（当培养体系开始浑浊时）进行保存。为实现最佳保存效果，需准备50%浓度的甘油溶液，通常可通过等体积的蒸馏水与甘油混合获得。在无菌条件下，将菌液与50%浓度的甘油以1:1的比例混合，确保甘油的最终浓度达到25%。接下来，将此混合物转移至2ml离心管，并保存在-20°C的冰箱中。在此温度条件下，菌种的保存有效期可达1年。若需长期保存，建议在-70°C或-80°C条件下进行冷冻保存，通常保存时间为2-4年。

菌种复苏

在复苏前，将保存的菌种放置于30°C水浴中解冻。解冻后，需将菌液接种到适合的固体培养基上，并在适宜的条件下培养24-48小时，以恢复菌种的活性，这是确保后续实验成功的重要步骤。

再次保存

复苏后的菌种可继续在新的液体培养基中培养，再进行甘油保存。这一过程不仅保护了菌种的长期稳定性，还提升了可用性，为后续研究提供了可靠保障。

注意事项

确保所有使用的工具和容器经过适当的灭菌处理，以避免污染。在整个操作过程中，必须保持无菌条件以防止外界微生物的入侵。此外，正确的保存与复苏方法对维持菌种的活性和纯度至关重要。需要注意的是，保存的温度对菌种的长期存活有巨大影响，低温条件有助于延长保存周期。

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