细胞冻存是一种在低温条件下保存细胞的方法，旨在长期维持细胞的活性和功能。这一技术对于细胞系的长期保存、实验的可重复性、基因库的建立，以及细胞治疗的储备等，都具有重要意义。通过冻存，能够有效降低细胞在传代过程中可能出现的遗传变异，并防止因污染、环境变化或实验操作失误引发的细胞损失。最佳的冷冻保存时机是在细胞以最佳生长速度时。

冷冻保护剂是细胞冻存过程中的关键成分，常用的包括二甲基亚砜（DMSO）和甘油。这些保护剂的主要作用是降低溶液冰点，减少冰晶的形成，从而保护细胞不受冰晶造成的机械损伤。DMSO是一种适用于大多数细胞类型的冷冻保护剂，但一些细胞对DMSO敏感，在此情况下可以考虑使用甘油作为替代品。

第1阶段：冷冻保存实验步骤

1. 在冷冻管上标记日期、研究人员姓名、细胞编号、传代数和细胞类型（以及其他有用信息，例如基因改造）。

2. 对于贴壁细胞，先除去细胞培养基，用PBS清洗，添加适量的胰蛋白酶以覆盖细胞，并在37°C培养箱中孵育约2分钟（具体时间根据实际细胞类型调整）。

添加等量的培养基终止消化，用移液枪轻轻吹打细胞，使贴壁细胞脱落，转移至50mL的Falcon管中。

3. 对于悬浮培养细胞，直接将所需体积的细胞转移至50mL的Falcon管中。

4. 使用血细胞计数器计数细胞以确定活力，冷冻保存的细胞活力应至少为75%。

5. 在室温下以300×g离心5分钟。

6. 准备冷冻培养基（见表1）。

表1：不同哺乳动物细胞系适用的冻存培养基配方

细胞类型 | 冻存培养基配方

在含有FBS的培养基中培养的细胞 | 90%胎牛血清 + 10%二甲基亚砜

在无血清培养基中培养的细胞 | 90%条件培养基 + 10%二甲基亚砜

需要甘油冷冻的细胞 | 90%胎牛血清 + 10%甘油

使用前混合均匀并加热至37°C。

冷冻培养基必须包含必要的冷冻保护剂，如DMSO，以防止形成可能损害细胞膜和结构的冰晶。请注意，DMSO并不适合所有细胞类型，在某些情况下可以用甘油替代。

7. 除去上清液。

8. 加入冻存培养基至所需的细胞密度。对于哺乳动物细胞，该浓度通常为1×10⁶/mL的冻存液。冷冻液中的细胞在室温下放置的时间不应超过10分钟。

9. 将1mL的样品分装到冷冻管中，并盖紧盖子。

10. 将冷冻管转移至室温的冷冻盒中，然后放入-80°C的冰箱。冷冻盒外周添加适量的异丙醇，以确保温度以每分钟1°C的速度稳定下降。缓慢的冷冻过程（每分钟下降-1ºC）能够帮助防止细胞内冰晶的形成。

11. 大约24小时后，从冷冻盒中取出冷冻管并转移至液氮中长期储存。一般来说，冷冻的细胞可以在液氮中保存数年。理想情况下，细胞不应在-80ºC下保存过长时间（最多一周），并应尽快转移至液氮保存，因在-80ºC下的长时间储存可能会损害细胞活力。

第2阶段：解冻冷冻细胞系实验步骤

1. 从液氮储存器中取出冷冻管，迅速放入37°C的水浴中，直至解冻约80%（请勿在室温下解冻）。此过程应不超1分钟。由于缓慢解冻会对细胞造成伤害，应尽快进行解冻。同时，DMSO具有一定的细胞毒性，因此细胞应以比室温下更快的速度解冻，以便快速稀释和去除DMSO。

快速解冻细胞的另一个目的是防止在冷冻过程中形成的晶体损害细胞膜或成分。

2. 使用移液器将冷冻管中的物质转移至含有约10mL预热培养基的15mL Falcon管中。

3. 在300×g下离心5分钟，弃去上清液，使用适量培养基重悬细胞沉淀。

4. 将细胞悬液转移至培养容器中，然后转移到37°C培养箱中培养。

通过遵循这些步骤，尊龙凯时为科研工作提供支持，确保细胞冻存和解冻过程的高效与安全。