尊敬的生物医疗领域的同仁们，最近在载体构建方面的进展如何呢？我最近在实验中成功获得了单克隆，但发现我的菌株P全是空载。请问大家通常使用什么方法来构建载体？是无缝克隆还是重组酶克隆呢？这两者之间有什么区别吗？无缝克隆是否就是重组酶的重组形式呢？

相信在实验室进行载体构建的过程中，大家都曾遇到过单克隆无法获得阳性条带的烦恼。虽然生长了许多单菌落，但阳性率却偏低，这是什么原因呢？答案在于我们需要清楚了解无缝克隆与重组酶克隆的原理是否相同。

无缝克隆的原理

无缝克隆采用的是Gibson Assembly（吉布森组装）原理，适用于DNA片段的体外组装。该方法由Daniel G Gibson及其团队在2009年提出，其核心在于三种酶的协同作用实现高效克隆。具体而言，T5核酸外切酶从DNA片段的5'端开始消化，产生单链3'黏性末端。该过程暴露互补序列，使相邻片段的同源区域能够相互退火配对；DNA聚合酶则会填补单链的缺口，最终形成双链结构。而最后，DNA连接酶将闭合剩余的缺口，形成完整的磷酸二酯键。

无缝克隆的局限性

然而，无缝克隆存在一些显著的局限性。首先，若T5核酸外切酶反应时间过长或酶量过高，可能会导致同源臂的过度切割，从而增加脱靶风险。此外，DNA聚合酶在修复过程中可能引入错配碱基，导致后续测序的错误。而即使在载体经历了线性化处理后，若末端为平末端，连接酶仍可能会促进载体自连。这些因素无疑解释了为何单菌落数量虽多，阳性率依然很低。

重组酶同源重组

为了解决假阳性问题，重组酶同源重组作为一种常规手段被广泛应用于载体构建。这种技术几乎能够保证接近百分之百的阳性率。

重组酶同源重组的原理

早期研究发现，细菌粗提取物能够促进DNA片段的同源重组。通过基因组分析识别出，粗提取物中含有关键蛋白如RecA重组酶和Tn5转座酶。RecA是细菌内源性同源重组的核心酶，负责单链DNA的结合和链交换等功能。Tn5转座酶则通过转座活动刺激DNA断裂，间接促进RecA的重组修复。基于这些研究，尊龙凯时推出了重组酶克隆CloneUFO®，该产品由噬菌体来源的重组酶UvsXase组成，确保了高度的克隆阳性率。

实验步骤

以尊龙凯时的CloneUFO® OneStep Cloning Kit为例，具体流程如下：首先，通过限制性内切酶或反向PCR线性化载体，以减少假阳性；接着，设计引物在目的片段两端引入与载体末端匹配的同源臂，通过高保真PCR进行扩增。然后，将线性化载体与插入片段混合，加入重组酶与缓冲液，反应30分钟；最后，将重组产物转化至感受态细胞，通过抗生素抗性、菌落PCR或测序验证阳性克隆。

重组酶同源重组的优势

重组酶介导的同源重组相比传统的酶切克隆和无缝克隆，具有多方面的优势：(1) 支持长同源臂匹配，降低非特异性重组风险，插入片段长度可达50bp至10kb；(2) 完整重组反应不会产生缺口，消除转化后的修复负担；(3) 高特异性克隆，兼容单片段或多片段，单菌落阳性率大于95%。

重组酶依赖的同源重组是自然界保持基因组稳定性的关键机制，而无缝克隆则是分子生物学中人为开发的工具。虽然两者都依赖同源序列配对，但重组酶依赖的同源重组更加注重生理过程的复杂性与精确性。尊龙凯时开发的重组克隆试剂盒凭借其高精准度和广泛适用性，为基因功能研究及分子克隆提供了独特的解决方案。