在之前发布的“叮咚！收下这份慢病毒包装的全攻略”和“慢病毒稳转细胞株的构建”两篇文章中，我们了解到慢病毒能有效将外源基因整合到宿主染色体上，从而实现长效表达，并且适用于几乎所有类型的哺乳动物细胞、干细胞和原代细胞。这些优点使得慢病毒成为一种强大的基因传递工具，并在生物医学领域获得了广泛应用。那么，在获得包装好的慢病毒后，我们应该如何进行下一步的操作呢？今天，尊龙凯时将为大家分享取得慢病毒后操作的详细步骤，内容丰富，敬请阅读！

1. 病毒的储存

包装好的慢病毒建议分装并保存在-80℃冰箱中，储存期限为半年。若超过半年，使用前建议重新测定病毒滴度。如果在短时间内（3-5天）进行实验，也可将其放置于4℃保存。同时，在病毒使用过程中，应尽量避免反复冻融，以免降低病毒滴度，可根据实验需求进行分装。

2. 病毒的稀释

如果需要稀释病毒，可先将其在冰浴中融化，再使用PBS或不含血清的培养基进行稀释，混匀后在4℃保存，建议在3天内使用完毕。

3. 预实验摸索慢病毒的最佳MOI

每种细胞对慢病毒的敏感性不同，因此在正式实验前需要通过预实验确定最佳感染复数（MOI）及其他感染条件。这些条件包括接种细胞的数量、感染时的总体积和换液时间等。以下为预实验操作步骤：

• 第1天：将健康生长的目标细胞以1×104个/孔接种于96孔板中，放入37℃、5% CO2的培养箱中过夜。接种细胞的数量可根据细胞的生长速度进行调整，一般建议第2天细胞密度达到30-50%。
• 第2天：根据实验需要或参考文献中获得的MOI值，设置梯度范围，一般为3-100。将从-80℃冰箱取出的病毒在冰浴中融化，根据假设的病毒滴度进行相应病毒原液的添加。
• 第3天：更换培养液，通常在病毒感染16-24小时后更换为正常培养液，继续培养。
• 第4-5天：感染效率检测。使用倒置荧光显微镜观察感染后的细胞，估计慢病毒感染的效率，并最终确定合适的MOI值用于正式实验。

4. 慢病毒感染目的细胞

在预实验中确认了慢病毒对靶细胞的亲嗜性以及MOI值后，可以进行正式感染实验。以下是以含有GFP荧光标记和Puromycin抗性的慢病毒感染细胞的具体操作步骤：

• 第一天：根据实验设计，将细胞以5-10×104 cells/孔的密度铺板，并在37℃下培养过夜。
• 第二天：感染前，将病毒从-80℃冰箱取出，冰浴融化后稀释至所需浓度。小心混匀，避免使用振荡器。
• 吸去细胞原有培养基，加注稀释好的病毒液，并根据预实验决定是否添加Polybrene。
• 感染后16-24小时，吸除含慢病毒的培养基，换为新鲜培养基。
• 继续培养48-72小时后，根据需要收集细胞进行目标蛋白的检测。

5. 目的细胞稳转株的构建

在成功感染细胞后，带有不同抗性的慢病毒能使细胞在含有对应抗生素的培养基中存活，而未感染的细胞则会死亡，因此可以通过抗性筛选获得稳定表达目的基因的细胞株。

• 多克隆稳转株筛选：将抗生素浓度降低至维持浓度，继续筛选感染后的细胞，并进行qPCR或Western Blot鉴定，确认表达情况。
• 单克隆稳转株筛选：对筛选后的细胞进行稀释培养，挑选单一细胞生长后的克隆进行扩增，以确认获得稳定表达的细胞株。

注意：不同细胞的依赖性可能不同，因此在进行单克隆筛选时，建议先进行预实验以确保细胞能正常增殖分裂。

以上是使用慢病毒进行细胞感染及稳定转株的基本步骤，希望这些信息能帮助您在生物医疗领域的实验中获得成功。更多关于生物实验的内容，请持续关注尊龙凯时的后续分享！